近日，浙江大学医学院附属妇产科医院生殖遗传科董旻岳主任团队和威尼斯欢乐娱人城精品生物合作，在Nature 子刊Laboratory Investigation （JCR Q1 医学：研究与实验）在线发表题为“Non-invasive Prenatal Screening for Common Fetal Aneuploidies by Single Molecular Sequencing”的研究成果，该论文基于威尼斯欢乐娱人城精品生物GenoCare 1600单分子基因测序仪开展了477例孕妇样本的无创产前筛查NIPS，T13，T18，T21的敏感性均为100%，整体特异性也接近100%。
背景介绍
无创产前筛查Non-invasive Prenatal Screening (NIPS)，是基于孕妇外周血对胎儿染色体非整倍性进行筛查的一种方式，主要用于T13、T18和T21的检测。目前最常用的技术手段是NGS测序。单分子测序不使用PCR，理论上可以去除PCR引入的GC偏向。在本研究中，我们对比了NGS测序平台NextSeq 550和单分子测序平台GenoCare 1600在NIPS的测序性能。
结果概要
实验设计与入组孕妇
图1 入组孕妇的孕周分布图
477名孕妇的孕周分布为12周-25周+6天，峰值在19-20周。195例为高龄孕妇（>35岁），占比40.9%（图1），T21，T18和T13的阳性例数为107，30和6例。
GenoCare 1600在NIPS的整体表现
测序数据过滤后，平均每例样本获得5.3±1.1 M unique reads，平均读长为36.3±1.4 nt。梯度截取不同的数据量(1.5 M，2.0 M，2.5 M，3.0 M和3.5 M以上reads)，以探究检测结果所需的最少reads数目，结果发现（图2）：
1、 仅需2 M reads，T13和T18的敏感度（sensitivity）即可达到100%，而T21需要3.5M以上reads才能达到；
2、整体特异性（specificity），随着数据量的增加而增加，在3.5M时，达到最大值97.31%；
3、2 M reads时，整体的阴性预测值（NPV）和T21的阳性预测值（PPV），均接近100%；
4、数据量大于3.5M时，T18和T13的阳性预测值（PPV），达到峰值，分别为99.07%和46.15%。
图2 不同测序数据量下的T13，T18，T21的检测结果
5、基于Z值的结果和羊水穿刺后胎儿染色体核型结果，T13和T21分别有6例和1例假阳性检测结果（图3）。
图3 染色体13，18和21的Z score分布
6、基于227例男胎评估胎儿浓度的检测限，发现正常孕妇的胎儿浓度低于3%，而T21和T18的最低胎儿浓度是3.47%和4.31%（图4）。
图4 单分子测序NIPS的胎儿浓度分布
GenoCare 1600与NextSeq 550在NIPS的测序性能对比
部分样本（对照n=22，T21 n=6， T18 n=2， T13 n=1）同时采用NextSeq 550做NIPS检测，计算Z值和GC偏向性。结果显示（图5）：
1、单分子测序T21，T18的Z值分布分别为6.44–12.52，9.46–24.77，而NGS测序T21，T18的Z值分布分别为3.47–7.52和6.65–21.20，单分子测序与对照界限的区分更加明显。
2、单分子测序的GC偏向性显著低于NGS测序(P<0.001)。
图5 单分子测序与NGS测序性能对比（a）Z score分布 （b）GC偏向性比较
讨论与结论
1、GenoCare 1600与NextSeq 550测序仪相比，操作更为简便，手工操作2小时，全流程一天内完成；
2、相对于NGS测序，单分子测序无需PCR，GC偏向性更低，实验操作更少，对实验室空间要求更低；
3、检索近3年全球基于NGS测序的大人群队列NIPS的研究文献，发现T13，T18和T21的阳性预测值分布0-84.4%，54.84-91.2%，和79.23-100%，单分子测序的表现更好；
结论
因全流程无PCR引入GC偏向，单分子测序仪GenoCare 1600可全方面提升NIPS性能，而其简单的文库构建方式，可以缩短项目交付周期和降低检测成本，今后更多样本的检测数据会有助于继续提升分析算法的准确性。